1. SD大(da)鼠，250g，通過頸椎脫位(wei)處(chu)死大鼠，浸入75%乙(yi)醇浸(jin)泡5分鐘，轉移到通風柜中(zhong)的解剖盤中(zhong)。

2. 打開皮膚，暴露、收(shou)集(ji)股(gu)骨，無菌狀態下移(yi)除附著的肌肉和組(zu)織。

3. 并轉(zhuan)移股骨至預冷(leng)含雙抗的(de)PBS中(zhong)，洗滌三次。冰上操作。

4. 切斷股骨(gu)骨(gu)骺， 使用5mlPBS，1ml注射器針頭沖(chong)洗(xi)，沖(chong)洗(xi)液由(you)棕色變成(cheng)粉紅色即(ji)可（股骨變白）。沖(chong)洗(xi)后，用1ml注射器吹打3-5次。

5. 70um濾網過濾，棄(qi)去篩網。使用 15ml 離(li)心管，先加入分(fen)離(li)液(ye)，然后緩慢加入濾(lv)過的懸液(ye)。20℃環(huan)境下，600g 離心 25min。

6. 離心后(hou)，離心管中(zhong)液(ye)體(ti)由(you)上至(zhi)下分(fen)為(wei)四層(ceng)(ceng)。第一層(ceng)(ceng)為(wei)稀釋液(ye)層(ceng)(ceng)。第二層(ceng)(ceng)為(wei)環狀乳白色(se)單個核細(xi)胞層(ceng)(ceng)。第三層(ceng)(ceng)為(wei)透明分(fen)離液(ye)層(ceng)(ceng)。第四層(ceng)(ceng)為(wei)紅細(xi)胞層(ceng)(ceng)。

7. 小心(xin)吸取(qu)離(li)心(xin)管中(zhong)的，環(huan)狀(zhuang)乳(ru)白色單個核細胞(bao)層，轉移到新(xin)離(li)心(xin)管中(zhong)，加入 5-10ml 洗滌液，混勻細胞。400g，離心 10min。

8. 棄去上清，用吸(xi)管吸(xi)取(qu) 5ml 清(qing)洗液重懸所得(de)細胞。 250g，離心(xin) 10min，棄去上清。 再用M199培養(yang)基（含10 ng/mL VEGF，1 ng/mL b-FGF，1 ng/mL EGF，20%胎(tai)牛血清、1%雙抗）清洗一次，棄去上清，M199培(pei)養基重懸細胞。250g，離心 10min，棄去上(shang)清(qing)。M199培養基(ji)重懸細胞，計數。

9. 按3×10⁶/孔(kong)種入纖連蛋白包被過(guo)的24孔(kong)板(ban)，每3天換一(yi)次培養(yang)基，以去(qu)除非貼壁細(xi)胞(bao)，持續(xu)誘導培養(yang)2-3周。