海馬神經元原代培養細胞實驗

一(yi)、背景

神經(jing)元原(yuan)代(dai)培(pei)養(yang)(yang)(yang)是將胚胎哺乳(ru)動物中(zhong)樞神經(jing)系統的(de)部(bu)分組織，如大腦皮層、海馬、脊髓(sui)等腦組織直(zhi)接取(qu)出，再接種培(pei)養(yang)(yang)(yang)的(de)方(fang)法(fa)。目前國內、外(wai)有關(guan)神經(jing)元培(pei)養(yang)(yang)(yang)的(de)方(fang)法(fa)較多，但在原(yuan)代(dai)培(pei)養(yang)(yang)(yang)中(zhong)神經(jing)元的(de)純度(du)和產量方(fang)面還存(cun)在一些急(ji)待解(jie)決的(de)問題。由于神經(jing)元是一種高度(du)分化的(de)細胞，相對(dui)于其它(ta)細胞而言，神經(jing)元在體(ti)(ti)外(wai)更難以存(cun)活(huo)和生長。因此，體(ti)(ti)外(wai)培(pei)養(yang)(yang)(yang)神經(jing)元要求的(de)培(pei)養(yang)(yang)(yang)方(fang)法(fa)和營養(yang)(yang)(yang)條件(jian)均較為特殊。

神經(jing)細胞的(de)(de)(de)體外(wai)培養技術是研究(jiu)神經(jing)源性疾(ji)病的(de)(de)(de)發(fa)(fa)病機制、進程的(de)(de)(de)一個重要工具(ju)，能(neng)很好的(de)(de)(de)、直觀的(de)(de)(de)反映離體神經(jing)元的(de)(de)(de)發(fa)(fa)育狀(zhuang)況和生理活性，如何(he)建立一個穩定成熟的神經細胞培養體系是神經系統疾病體外實驗研究順利進行的基礎。隨著基礎醫學及臨床醫學研究的逐漸深入，神經細胞的體外培養技術在腦損傷、神經障礙性疾病、衰老相關神經疾病方面得到廣泛重視和普及應用。

二、海馬神經元原代培養細胞實驗步驟

(1)75% (體積分(fen)數)酒精消毒孕鼠,在無(wu)菌條件下(xia)取(qu)出胎鼠,分(fen)離并去除海馬,置(zhi)于冷的(de)(de)無(wu)鈣、鎂的(de)(de)HBSS液的(de)(de)平皿(min)中( 下(xia)置(zhi)冰袋)。

(2)解剖顯(xian)微鏡無菌條件下仔細(xi)剝離海馬。

(3)用彈簧剪(jian)將海馬剪(jian)成1cm3大小，消(xiao)化(hua)液37℃消(xiao)化(hua)15-20min，每(mei)五分鐘振(zhen)蕩一次(ci)；

(4)去掉上清(qing)，加入(ru)終止液(ye)終止消化，吹打10-15次，不(bu)能有氣泡，收集上清(qing)，剩余組(zu)織再消化一次。

(5)4℃1000rpm離心10min，棄上清，加入(ru)種植(zhi)液1重懸，培養箱內差(cha)速貼壁(bi)30min；

(6)收(shou)集上清(qing)，臺盼藍染(ran)色計數，按6*105cells/孔(kong)種(zhong)入(ru)六孔(kong)板（種(zhong)植液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕度(du)的培養(yang)(yang)箱中培養(yang)(yang)；

(7)培養第二天，全換(huan)液(ye)更換(huan)為(wei)種植(zhi)液(ye)2；

(8)培(pei)養第四天(tian)，半量(liang)換液加入5uM的阿(a)糖胞苷，24h全量(liang)換液；

(9)之(zhi)后(hou)每周(zhou)換液兩次。