大鼠神經元原代培養細胞實驗

一、背景(jing)

神(shen)(shen)經(jing)(jing)元原代培(pei)養是(shi)將胚胎哺乳動物中樞神(shen)(shen)經(jing)(jing)系統(tong)的(de)部分(fen)組織，如大(da)腦皮(pi)層、海馬、脊髓等(deng)腦組織直接(jie)取出(chu)，再接(jie)種培(pei)養的(de)方(fang)法(fa)。目前國(guo)內(nei)、外(wai)有關神(shen)(shen)經(jing)(jing)元培(pei)養的(de)方(fang)法(fa)較(jiao)多(duo)，但(dan)在(zai)原代培(pei)養中神(shen)(shen)經(jing)(jing)元的(de)純度和產(chan)量方(fang)面還存在(zai)一(yi)些急(ji)待解決的(de)問(wen)題。由于(yu)神(shen)(shen)經(jing)(jing)元是(shi)一(yi)種高(gao)度分(fen)化(hua)的(de)細(xi)胞，相(xiang)對(dui)于(yu)其它細(xi)胞而言，神(shen)(shen)經(jing)(jing)元在(zai)體外(wai)更難以存活和生長。因此，體外(wai)培(pei)養神(shen)(shen)經(jing)(jing)元要求(qiu)的(de)培(pei)養方(fang)法(fa)和營(ying)養條件均較(jiao)為特殊。

神(shen)經細胞的(de)(de)(de)體外培養技術是研究神(shen)經源性疾病(bing)的(de)(de)(de)發(fa)病(bing)機(ji)制、進程的(de)(de)(de)一(yi)個重要工具，能很(hen)好的(de)(de)(de)、直觀的(de)(de)(de)反映離(li)體神(shen)經元的(de)(de)(de)發(fa)育狀況和生理(li)活性，如何(he)建立一個穩定成熟的神經細胞培養體系是神經系統疾病體外實驗研究順利進行的基礎。隨著基礎醫學及臨床醫學研究的逐漸深入，神經細胞的體外培養技術在腦損傷、神經障礙性疾病、衰老相關神經疾病方面得到廣泛重視和普及應用。

二、大鼠神經元原代培養細胞實驗步驟

(1)75% (體積分數(shu))酒(jiu)精消毒孕鼠(shu),在無菌條件(jian)下取出(chu)胎鼠(shu),分離并切取脊髓,置于冷(leng)的(de)無鈣、鎂(mei)的(de)HBSS液的(de)平皿中( 下置冰袋(dai))。

(2)解剖顯微鏡無菌條(tiao)件下(xia)仔細剝離脊膜及(ji)血管(guan)。

(3)用彈簧(huang)剪將脊髓剪成1cm3大小，消(xiao)化液37℃消(xiao)化15-20min，每五分(fen)鐘(zhong)振蕩一次；

(4)去(qu)掉上清，加入(ru)終止液(ye)終止消化，吹(chui)打10-15次(ci)，不能有氣泡(pao)，收集上清，剩余(yu)組織再消化一(yi)次(ci)。

(5)4℃1000rpm離心10min，棄上(shang)清，加入(ru)種(zhong)植液1重懸，培養箱內差速貼(tie)壁30min；

(6)收集上清，臺盼藍染色(se)計數，按6*105cells/孔種入(ru)六(liu)孔板（種植液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕度的培養(yang)箱中培養(yang)；

(7)培養第二天，全換液更換為(wei)種植液2；

(8)培(pei)養第四天(tian)，半(ban)量換液加入5uM的阿糖胞(bao)苷，24h全量換液；

(9)之后每周(zhou)換液兩次。